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摘要:
Wiener在控制论(Cybernetics)中强调了两大类控制对象: 机器与动物. 半个世纪以来, 机器控制领域已形成一套较为完备且先进的控制理论, 而在生物控制方面, 由于生物系统的特殊性和复杂性, 对生命的基本组成单位—细胞的控制仍然进展缓慢. 近年来, 随着合成生物学技术的发展, 基于细胞—计算机交互的胞外控制手段开始引起研究者们的关注, 为细胞控制带来了前所未有的机遇. 胞机交互的方式能够适应生物系统的特殊性, 发挥计算机控制的优势, 实现细胞的自动化实时控制, 为人类研究细胞内部基因调控机制与其他各项生命活动提供了大量的数据与方法支持. 本文根据目前基于胞机交互的细胞控制工作, 归纳与总结了胞机交互中常用的生物学工具以及控制算法, 分析了细胞控制的特殊性与难点, 指出研究实现细胞智能控制的可行性与重要性.
Abstract:Wiener emphasized two major categories of control objects in cybernetics: machines and animals. In the past half century, a relatively complete and advanced control theory has been formed in the field of machine control. However, due to the particularity and complexity of biological systems, the control of cell, the basic unit of life, is still progressing slowly. In recent years, with the development of synthetic biology tools, in silico control methods based on cell-computer interfacing has drawn researchers＇ attention, bringing unprecedented opportunities for cell control. These methods can adapt to the particularity of biological system, take advantages of in silico control, realize automatic real-time cell control and provide a large amount of data and methods for human research on endogenous gene regulation mechanism or other activities. Based on current progress, this review summarized the biological tools and control algorithms used in cell-machine interfacing, illustrated the particularities and difficulties and pointed out the feasibility and importance to achieve intelligent cell control.
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Key words:
- Cell-computer interfacing /
- feedback control /
- synthetic biology /
- artificial biosystem /
- optogenetics
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1948年, Wiener在其著作《控制论: 关于在动物和机器中控制和通讯的科学》中首次提出了“控制论”的概念, 阐述了自然科学以及社会科学等各个领域的控制思想, 强调了对生命与机器统一的控制规律, 奠定了“控制论”的基础. 同时, 它提出了两大类控制对象, 即无生命的机器和有生命的动物[1]. 大半个世纪以来, 机器控制领域不断有着突破性的进展, 已经逐渐形成一套较为完备且先进的控制理论, 并广泛应用于各种工程项目中. 而生命作为一个完整的系统, 大至生态系统的平衡, 小至单个细胞内的稳态建立, 处处体现着控制论的思想, 与机器控制有许多共通之处. 因此, 理论上来说, 通过选择与设计适当的方法, 人们同样可以控制生命的基本组成单位 — 细胞.
然而, 长期以来, 由于生物系统的强复杂性以及基因表达的高随机性等诸多原因[2-3], 细胞控制研究进展缓慢. 随着合成生物学与系统生物学的不断发展以及相关技术的逐渐成熟, 人们对细胞内的生命过程以及细胞间相互作用机制的理解日益深入, 并开始利用合成基因线路对细胞内基因表达及其他生命活动进行控制, 构成人工生物系统. 在合成生物学领域, 抑制子振荡器[4]与双稳态开关模型[5]是两个经典的人工合成基因线路. 抑制子振荡器通过三个互相抑制的基因线路 (tetR,
$\lambda $ cI, lacI)构成基因网络, 当给予一定初始浓度的诱导物时, 三个基因的表达会呈现出振荡特性(图1(a)). 而双稳态开关模型则是通过两个互相抑制的基因线路 (lacI, tetR)以及能够分别抑制两种基因表达产物的化学诱导剂来实现类似开关的双稳态特性(图1(b)). 它们都是以互相抑制的基因线路构成负反馈来实现对基因表达特性的调控. 实际上, 反馈机制大量存在于细胞内源的基因网络中, 目前也已经有许多工作通过向细胞中引入人工反馈环的方式实现对基因表达量、表达噪声以及表达稳定性的调控[6-14].
图 1 利用人工合成基因线路控制细胞的基因表达Fig. 1 Control gene expression using artificial synthetic gene circuits虽然通过合成基因线路, 人们能够对细胞的生命活动进行调控, 但是传统的基因线路存在着以下局限性: 1)设计符合要求的基因线路十分困难, 需要考虑元件功能、元件正交性、稳定性等诸多因素. 2)基因线路的规模受到细胞环境和细胞内资源的限制, 因而难以实现复杂的生物功能. 3)基因线路的调控是“一次性”的. 一旦合成基因线路导入质粒并转化到细胞中, 其调控模式就不可更改. 如果调控结果无法达到预期, 研究者需要修改甚至重新设计基因线路, 材料消耗大, 时间周期长, 可调节性弱[15-16]. 相较于此, 科学家们更期望设计一种简便、高效的细胞控制模式, 通过细胞的实时响应, 研究其内部线路的动态特性.
近年来, 控制遗传学(Cybergenetics)概念的提出使科学家们开始关注和探索一种全新的基于细胞—计算机交互(以下简称胞机交互)的体外细胞控制模式[16-17]. 它类比自动控制领域中由控制器、执行器、被控对象、测量变送器构成的系统结构: 以计算机为控制器, 通过运行相应的控制算法, 不断对测量变送器的反馈信号进行处理并施加相应的控制信号; 以光源、加药泵等能直接控制细胞内基因线路的工具为执行器, 将来自控制器的控制信号转换为相应的形式; 以细胞内的基因线路为被控对象, 接受来自执行器的输入并将自身的响应由测量变送器返回给控制器; 以显微镜、相机等作为测量变送器, 将输出信号转换为能被控制器识别的荧光图像、细胞影像等形式(图2). 由于计算机程序运算准确、响应快速、易于修改, 胞机交互系统能够实时观测细胞表达量, 并通过程序计算得到当前时刻所需的控制输入量, 实现在线细胞控制. 并且, 相比于要在细胞内部完成复杂计算、控制功能的基因线路, 通过计算机来完成控制运算可以显著减小基因线路规模和设计实现难度.
在计算机与细胞的连接过程中, 执行器的控制信号与测量变送器的反馈信号对细胞状态进行着实时控制与监测, 起到关键的接口作用. 控制信号不仅应当在维持细胞内部其他生理功能正常运转的前提下, 激发细胞内部基因线路的表达, 还需要能够被计算机精准地调节, 根据当前的细胞状态快速改变取值. 而反馈信号则应当真实反映细胞的状态变化, 并将其转换为计算机能够准确识别和处理的形式. 目前常用作细胞控制信号的有化学诱导因子[18-24], 环境因素如渗透压[25]、温度[26]等, 特别地, 随着近几年各种光遗传学工具的发现, 使用不同波长的光照控制细胞活动成为了一大焦点, 许多合成生物学家开始利用光作为控制信号[27-35]. 相比于化学药物以及环境因素, 光照对细胞的损伤更小, 可控性更强, 操作也更简便. 对于反馈信号, 由于计算机图像处理技术的成熟, 目前的方法通常是由计算机对显微镜下细胞的荧光图像或影像进行分析, 得到细胞形态、位置、荧光强度等一系列参数信息, 用于控制信号的计算[32, 36].
本文着眼于近年来胞机交互控制模式在细胞控制领域取得的研究进展, 对已有的相关工作进行总体概述, 介绍其中所用的细胞状态的监测与控制手段以及相关控制算法, 重点阐述生物系统的复杂性以及控制算法在细胞中实现的特殊性与挑战, 展望细胞控制未来的发展方向, 特别是国内在此领域的研究现状与前景.
1. 胞机交互中耦合接口的实现
在胞机交互系统中, 细胞的培养、状态的读写是进行细胞控制的前提, 它们在保证细胞活性的前提下, 构成了细胞与计算机耦合的接口. 活细胞与计算机的耦合依赖于对细胞状态的实时监测与控制, 即细胞状态参数的读取和控制信号的写入. 以合成生物学技术为主要技术的人工基因线路为我们实现这种细胞—计算机之间的耦合接口创造了条件. 目前, 合成生物学技术的快速发展, 使得我们可以合成任意排列的DNA序列, 从而按照功能需求来设计和构建人工的基因线路. 将这种特定功能的基因线路植入细胞, 充当细胞内的生物传感器[37-38], 研究者就可以通过其检测活细胞内的代谢物、RNA、蛋白等生物分子状态的变化, 并将其转换为荧光亮度等易于被硅基系统监测的输出信号[39-41]. 同样, 利用人工基因线路编码特定蛋白来接受人为控制的化学药物、渗透压、光照等控制信号, 并将信号接入到细胞内源的调控网络, 就可以将细胞纳入控制系统的闭环. 本部分将从细胞控制的需求出发, 简要地介绍细胞培养与实现细胞与计算机两方面耦合接口所依赖的相关技术、培养平台以及常用的控制信号.
1.1 计算机对细胞的状态参数读取
要实现对细胞实时施加合适的控制信号, 选择能够直观反映当前时刻细胞状态的输出变量是必不可少的. 荧光成像、细胞影像等常用状态反映手段都是将不可测的细胞状态转化为易于观察分析的变量. 通过合成生物学技术在细胞内嵌入标记信号, 利用荧光成像技术, 如荧光蛋白、mRNA探针、免疫杂交反应等, 可以快速测量活细胞内的生物分子信号, 从而直观地反映基因表达水平; 而通过一系列图像处理技术, 细胞影像也能提供丰富的状态信息, 包括细胞形态、位置以及其他与研究问题相关的动力学参数. 除此以外, 细胞的外泌物如细胞因子、代谢物质、外泌体等也有潜力用于细胞状态的监测.
细胞影像的处理过程一般包括细胞分割与细胞追踪两个阶段, 针对影像的每一帧, 我们首先将细胞识别并分割出来, 分割的方式既可采用数字图像处理的方法, 如阈值法、分水岭算法等, 也可以采用如文献[42-43]的神经网络方法. 在分割出每一帧的细胞之后, 我们需要将同一个细胞在不同帧的位置联系起来, 即细胞追踪. 细胞追踪的方法大致可分为基于运动模型的方法[44]和基于深度学习网络的方法[45]: 基于运动模型的方法要求对细胞的外形、移动、交互、碰撞、遮挡等活动进行建模, 然后采用卡尔曼滤波等方法根据历史帧信息对当前帧细胞位置进行预测, 通过比较预测结果与当前帧细胞位置的相似程度, 确定两个细胞是否应被视为同一目标. 而基于深度学习网络的方法则要求提取细胞的外形、位置等多维特征, 依据提取的特征对不同帧细胞之间进行匹配. 细胞追踪完成后, 我们就可以从图像中读出各个细胞当前的具体状态, 从而根据控制算法改变控制信号的输入.
而在实际操作中, 由于活细胞体积微小、数量众多且活动范围较大, 想要在显微镜下跟踪细胞状态、直接运行图像处理算法获得状态参数、对每个细胞都施加精准的控制信号是十分困难的. 并且, 长时间控制细胞需要维持细胞的活性, 为细胞提供合适的生长环境与充足的营养物质. 因此, 胞机交互的培养平台需要能够维持细胞的长期生存; 适当限制细胞的活动范围, 以便于跟踪每个细胞的位置; 在单细胞水平上进行状态参数的读取以及控制信号的精准写入等. 在目前的细胞培养技术中, 微流控是能够满足上述条件的一种培养系统[46-54].
微流控采用微管道技术, 以精确、自动化的控制进行微小体积液体的操作, 能够同时并行多个实验, 并最大限度地减少手工操作带来的误差, 在单细胞水平上精确地控制细胞. 同时, 通过将细胞限制在长窄通道[47]或是小培养室[51]内, 微流控能最大程度地及时排出增殖的细胞, 避免细胞拥挤, 限制细胞的活动范围, 使细胞位置易于追踪, 简化控制信号与被控细胞间的校准问题. 结合显微镜成像技术, 研究者们能够在单细胞水平上得到微流控平台中细胞的实时影像, 进而通过图像处理技术, 快速计算读取细胞反馈回的状态参数, 极大地便利了胞机交互的实施.
1.2 计算机对细胞的控制信号写入
随着合成生物学的发展, 人工生物系统能够感知的信号类型越来越丰富, 人们对细胞的控制手段也越来越多样化. 从传统生物学采用的温度、营养和化学试剂等控制手段[26, 55-56], 到当前合成生物学中采用的化学小分子信号, 磁信号[57-60], 电信号[61-62]和光信号[63-66]等, 通过计算机对相关执行器的控制, 并以细胞中导入的人工合成基因线路作为媒介, 对细胞内的分子状态和基因表达状态进行控制, 人们控制细胞的手段逐渐扩展并相互融合.
采用化学信号控制的分子开关在整个合成生物学的发展过程中起着核心作用[38], 但随着合成生物学的发展, 人们也逐渐意识到化学信号的固有缺陷, 诱导剂的难以去除, 诱导剂的毒害性, 扩散效应的滞后性等问题逐渐显现出来. 同时, 随着对生物系统的进一步认识, 研究者们发现, 通过相关基因线路的设计, 将细胞改造为能够接收光、电、磁等控制信号的细胞, 同样能实现对细胞的调控. 其中由于光学信号具备时间和空间上的高分辨率和可逆性, 光遗传学在近十几年内发展迅速, 研究者们已经在细菌[67]、酵母[68]和哺乳动物细胞[69]内设计出了可用的光遗传学工具, 极大地拓宽了人们控制细胞的手段.
随着光遗传学的逐渐发展, 各类光敏元件逐渐被发现或人工构建, 在细菌和真核生物中的光传感器均已能够感知紫外光、蓝光、绿光和红光等不同波长的光信号[70]. 光传感器接收特定波长的光信号后会发生蛋白结构的变化, 例如蛋白封闭、二聚反应、齐聚反应和解聚反应等[71].
光遗传学系统通常可以根据光传感器的参与组分分为两类, 第一类为单组分系统(One-component system), 光传感器游离在细胞质中, 接受光信号后发生结构变化进而调控基因表达. 另一类为双组分系统(Two-component system), 需要细胞膜上光传感器蛋白接受光信号后, 通过磷酸化途径和辅因子传递给细胞质蛋白再进行基因的表达调控.
1)单组分系统: 单组分系统中光传感器能够在接受特定光信号后, 直接使蛋白结构发生一定的变化, 导致蛋白活性产生影响, 而不需要辅因子的参与. 其主要为包含LOV 结构域(Light-oxygen-voltage-sensing domain)类型的光敏元件(图3(a)). 例如, 利用EL222蛋白设计的光敏启动子, 能够在蓝光照射下形成二聚体蛋白, 结合特定DNA序列进行基因表达调控[72].
2)双组分系统: 双组分的光响应系统在接受光信号后, 需要特定的辅因子进行活性调节, 将信号通过磷酸化作用进一步转递, 直到终末蛋白对特定的启动子进行调控(图3(b)). 例如紫外光响应系统UirS/UirR[73], 蓝光响应系统YF1/FixJ[74], 绿光响应系统CcaS/CcaR[75], 红光响应系统Cph8/OmpR[67]均为双组分系统, 需要一定的辅因子参与级联反应.
近年来光遗传学的迅速发展为人们进行细胞控制提供了一种更有效和准确的途径. 例如在图3(c)中, 我们参照文献[76]中构建的光控基因表达系统, 将感光基因线路导入细胞, 通过投影仪照射, 使处在特定位置的细菌表达色素基因, 与相应的底物反应, 从而显示出所照射的图像, 展现了利用光照作为控制信号的有效性与精准性. 光的高分辨率和高度可控性, 为保证细胞控制输入信号的稳定性提供了坚实的基础. 但目前光遗传学元件尚处于发展阶段, 一些问题仍需解决, 例如, 光控基因表达本底较高、光敏元件交叉反应[77]等.
2. 胞机交互中的控制方法
在控制领域中, 控制方式可根据是否存在反馈分为闭环控制与开环控制, 这对于细胞的控制同样适用. 开环控制需要选择合适的输入量与输出量, 通过实验观测和系统辨识的方法对所研究的生物系统进行准确的建模, 然后根据模型和输出期望值计算得到所需输入, 一次性施加到生物系统当中. 2014年, 莱斯大学的Olson等[34]在大肠杆菌细胞中建立了一套精确的数学模型, 以多种波长的光照序列开环调控大肠杆菌基因表达量随时间的变化, 得到了可以产生自定义波形的生物信号发生器. 2017年, 该团队进一步增强了模型的定量预测能力, 优化了模型参数的校准过程, 使多路光遗传学系统能够同时对细胞的基因表达进行稳定控制[35].
然而, 在生物系统中, 各项生命活动的影响因素很多, 如果将所有影响因素都纳入考虑, 会使模型变得极为复杂甚至不可解, 因此, 对所有系统都进行精确地建模是十分困难的. 一般在建模时, 我们仅可能考虑理想情况下存在的主要生命活动和反应, 这实际上是对真实网络的简化, 只能在一定程度上体现基因网络的动态特性. 并且, 模型参数的精确性依赖于特定的培养环境, 当环境出现变化和扰动时, 预测精度就会下降, 所以开环系统一般不适用于对细胞的长期控制[27]. 闭环系统则不同, 它根据当前的实际输出与期望输出的误差来实时改变控制量输入, 从而对意外的扰动和噪声有更强的抑制或补偿作用, 相较开环控制能更好地减小误差, 降低对模型精度的要求, 增强稳定性. 因此, 目前大多数细胞控制工作所采用的控制方式都是反馈控制[16]. 本节重点针对反馈控制算法在细胞控制系统中的应用进行综述, 比较各控制算法在细胞控制问题上的性能优劣, 归纳和总结细胞控制与机器控制的不同点和难点.
2.1 控制算法在细胞中的应用
在胞机交互的控制体系下, 控制算法由计算机程序实现, 并通过药物浓度、光照强度、波长等控制信号与细胞连接, 研究者可以根据具体情况选择、设计和运用各种合适的控制算法. 在控制领域中, 使用最广泛的控制方法当属比例—积分—微分控制(Proportional-Integral-Derivative control, PID), 它通过实际输出与期望输出之间误差的比例、积分、微分项来对系统进行调控. 2011年, PI控制算法首次被用于调控蛋白质的定位过程, 通过引入Phy-PIF 光遗传学系统, 并构造带有光敏素互作因子 (Phytochrome-interacting factor, PIF)标记的融合蛋白, 细胞膜就能够随不同的发光二极管 (Light emitting diode, LED)照射改变招募蛋白的强度, 而计算机又反过来通过招募蛋白的程度调整LED光源, 从而使膜蛋白招募的动态特性完美符合人们的预期响应[28]. 目前已有越来越多的工作采用PI控制算法来控制细胞内基因表达特性[18-21, 23, 29]、细胞生长速度[27]等生命活动指标.
PID控制的计算简单, 不依赖于模型, 但在非线性长时延系统中效果较差[20]. 为了解决生物系统中的时延问题, 模型预测控制(Model predictive control, MPC)是一种常用的、更精细化的反馈控制方法. 模型预测控制利用控制对象的动态模型计算出未来一段时间内系统的输出值, 进而根据预测的输出施加相应的控制输入, 补偿了系统时延造成的影响. 目前, 模型预测控制也被广泛地运用在生物信号发生器[16]、基因表达调控[24, 30]以及细胞状态 (如细胞生长[27]、细胞周期[22]) 的控制等研究当中.
除此以外, 起停式控制方法(Bang-bang control)也可用于细胞控制. 起停式控制是最简单的反馈控制算法之一, 其控制量根据实际输出与设定阈值的大小关系分别取两个不同的固定值, 这种二值的控制输入类似于电路中的开关, 因此起停式控制也被称为开关控制. 目前, 研究者已成功利用起停式控制方法实现了细胞内蛋白浓度的实时调节[33]、将细胞状态稳定在双稳态开关模型的非稳态平衡点附近[19]等功能. 另外, 来自意大利的Fiore等[20]和Guarino等[23]还将电力系统控制中的零平均动态(Zero average dynamics, ZAD)控制方法运用到基因表达动态特性的控制当中. ZAD控制是一种数字控制方法, 它利用脉宽调制技术(Pulse width modulation, PWM)调节输出值, 通过寻找合适的脉冲宽度, ZAD使得每一个PWM周期内输出值与参考值的误差均值为0[78]. 表1总结了上述各种控制算法的优势与不足.
表 1 细胞控制常用控制算法优缺点比较Table 1 Pros and cons of several control algorithms in cell control控制算法 是否需要精确建模 优点 缺点 PID控制 否 稳定性好, 计算简便, 不依赖模型 在快速变化的、长时延的系统上效果较差 模型预测控制 是 适用于时变的、有时延的系统, 能够预测未来状态 计算复杂度高, 易受噪声影响, 建模过程繁琐 起停式控制 否 结构最简单方便 控制动作不连续, 容易造成系统振荡 ZAD控制 是 适用于时变的、有时延的系统, 减少了输入开关数量 在快速变化系统中的表现略逊于模型预测控制[20] 2.1.1 胞机交互调控基因表达
在细胞内, 基因表达过程具有高随机性, 受到多种环境因素如温度、营养物质、药物诱导等的影响, 在时间与空间上都存在较大的噪声[2-3]. 噪声的存在使得准确预测基因表达量, 探索基因调控网络的内部机制变得困难, 而利用胞机交互的手段, 研究者可以对所研究的基因加入实时可调的控制信号, 对外界扰动及基因表达的内源噪声进行补偿, 控制基因表达量处于一个稳定的水平. 例如, 加利福尼亚大学旧金山分校的Harrigan等分别突变了酵母增殖信息素通路中与负反馈相关的三个信息素基因, 利用基于光遗传学工具和模型预测控制的体外控制方法, 使得三种缺少内源反馈通路的突变型细胞均能够表现出与野生型相同的表观特性[30]. 外部控制的引入补偿了基因突变引起的扰动, 降低了基因表达的噪声, 增强了其可预测性与稳定性.
除了将基因表达量维持在期望的表达水平之外, 胞机交互实时施加的控制信号还能够使基因表达量按照预期产生各种各样随时间变化的波形, 构成生物信号发生器[16]. 在实现了对基因表达量进行稳态控制的基础上, 人们开始尝试将设定值设置为随时间变化的波形, 发现当采用模型预测控制等适用于时变信号的控制方法时, 荧光蛋白的表达量能很好地实时跟随控制信号输入, 呈现出锯齿状、阶梯状或是正弦波的波形[20]. 生物信号发生器可以进一步作为下游基因线路的输入, 通过胞机交互, 细胞能够产生比常用的阶跃信号更为复杂的输出信号, 通过观察基因调控网络在各类刺激下的响应, 研究者们能获得比传统的基因敲除等静态方法更加丰富有效的信息, 建立起更准确的基因调控网络动力学模型, 进而揭示基因调控网络的内在机制[16].
2.1.2 胞机交互控制细胞状态
细胞状态主要依赖于细胞内基因表达的情况, 因此, 通过控制与各项生命活动相关的基因或其他信号分子, 胞机交互就能够控制细胞的大小、周期、生长速度等状态参数. 2016年, 苏黎世联邦理工学院的Milias-Argeitis等[27]通过将细胞内控制甲硫氨酸生物化学合成的metE基因改造成光控基因, 以红色和绿色的LED光照作为控制信号, 采用PI控制算法得到了在不同光照下具有不同生长速度的突变型大肠杆菌.
此外, 胞机交互还能够在一定程度上影响细胞决策. 细胞的生命过程包含了大量的决策, 例如哪些基因表达、基因何时表达、表达出多少蛋白质等, 不同的决策会引导细胞走向完全不同的状态[79]. 细胞决策的不同实际上反映了细胞所处稳态平衡点的不同, 因此, 如果能控制多稳态系统进入设定的稳态, 就相当于控制了细胞决策. 双稳态开关模型是一个典型的双稳态系统, 它包含两个稳定平衡点和一个不稳定平衡点[5], 利用PI和起停式控制方法控制双稳态开关模型中诱导剂无水四环素 (Anhydrotetracycline, aTc) 和异丙基-
$\beta $ -D-硫代半乳糖苷 (Isopropyl$\beta $ -D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)的输入量, 细胞状态可以被稳定在双稳态开关模型的非稳定平衡点附近[19], 通过周期性地施加合适的aTc和IPTG信号, 细胞会分别落入不同的稳态平衡点, 实现对细胞状态决策的控制.2.2 控制算法在细胞控制中应用的特殊性与难点
虽然通过将细胞看作与机器相互统一的系统, 目前已经有部分研究者成功地采用经典控制算法实现了对细胞的初步控制, 但是, 细胞作为生物体基本的结构和功能单位, 它是自然界经过数十亿年进化的产物, 拥有比世界上任意一台机器更精细的内部结构与机理, 它本身存在许多尚未揭开的奥秘, 加上细胞体积微小, 只有在显微镜下才可见, 细胞控制的控制量输入与结果观测都比机器控制更加复杂. 另外, 细胞的生命活动对环境与营养物质有苛刻的要求, 胞内的各种酶需要在最适温度和酸碱度条件下才能正常行使功能, 否则, 即使控制算法和系统模型设计无误, 我们也无法观测到预期的现象. 本节综合说明实际操作时细胞控制与机器控制相比的特殊性与控制算法设计时需要注意的一些问题及其解决手段.
2.2.1 控制信号的限制
PID等经典控制算法在计算控制信号输入时一般是没有条件限制的, 其结果取值范围往往是整个实数域, 但是在实际操作中, 由于受到阀门、光源等执行器的固有属性限制, 当控制算法计算得到的控制量超过执行器的调节范围(阀门的最大开度, 光源的最大亮度)时, 执行器不会对该控制量做出应有的响应, 此时的控制系统相当于开环系统, 实际输出与预期输出的误差随时间积累会越来越大, 最终造成系统产生超调或时延, 这种现象称为积分饱和, 在机器控制领域普遍存在, 而在细胞控制中尤为显著. 在进行双稳态开关模型的稳定实验时, 研究者便有意忽略了前两个小时的积分来避免这一现象[19]. 除此之外, 还可以在反馈闭环中加入anti-windup模块[20, 80], 当控制器正常工作时, anti-windup模块不发挥作用; 一旦执行器的输入与输出信号不相同, anti-windup模块便会计算输入输出的误差, 并据此调节PID控制器中积分项的大小, 避免饱和带来的超调和时延[80].
控制信号可能受到的另一种限制是执行器不能按照控制算法得到的结果向被控对象传输精确而连续的控制信号, 例如阀门只能打开一个大致的开度、执行器只能进行离散的档位调节等. 在细胞控制领域, 控制信号的细微差异, 可能会对细胞的整个状态带来巨大的变化, 甚至会导致细胞死亡. 为解决此问题, 研究者们想到利用电力电子技术中的脉宽调制技术(PWM), 在控制器后加入PWM调制模块, 将数字信号等效转化为所需的模拟信号[18], 使执行器的离散信号表现出等价于连续信号的控制效果. 对于能够连续取值的控制工具例如LED、激光等光源, 则可以有效避免此问题.
2.2.2 细胞固有属性的限制
细胞与机器最明显的区别在于细胞是一个生命体, 会进行运动、生长、增殖等生命活动, 且自身体积微小, 需在显微镜下方可观察, 而控制工具的分辨率很难达到单细胞水平, 因此实验中往往只能控制细胞的群体特性, 难以捕获单细胞的动态. 即使利用某种精密的控制手段实现了单细胞的控制, 由于细胞间的基因表达差异, 每个细胞所需的控制信号输入也是不同的, 加上细胞会不断运动和增殖, 如何完成控制信号和被控细胞间的校准、如何处理分裂后的细胞、如何对细胞信号进行测量都是需要解决的问题. 这就要求有专门的实验平台来精确地控制每一个细胞与读取细胞状态.
早期的胞机交互控制多是针对细胞群体水平上基因表达量的控制, 但近年来, 越来越多的科学家开始尝试利用微流控系统和高分辨率的投影仪进行单细胞水平的反馈控制. 第1节中提到, 微流控系统能够最大程度地限制细胞的活动范围, 解决了细胞运动与分裂的问题, 使细胞易于追踪. 而在单细胞水平上对细胞施加控制信号则可以由数字微镜(Digital micromirror device, DMD)投影仪实现. DMD投影仪的核心由微型反射镜阵列构成, 通过独立开闭每个反射镜, DMD投影仪能够改变单像素的光信号强度, 实现单细胞水平上的高通量控制[81]. 例如, 2018年, 来自苏黎世联邦理工学院的Rullan等[36]利用胞机交互的控制方式, 以DMD投影仪为控制信号源, 微流控系统为培养平台, 实现了对酿酒酵母mRNA水平上的单细胞基因表达控制.
2.2.3 基因表达特性的限制
在细胞内, 基因表达包括转录、翻译等多步过程, 细胞对信号产生响应需要一定的时间, 所以控制信号写入到系统响应和观测之间存在较大的时滞. 其次, 细胞基因表达调控的传递函数近似满足希尔方程的形式, 是高度非线性的. 因此, 基因表达过程是一个典型的非线性时延系统[82]. 前文提到PID控制更适用于无时延和无剧烈波动的系统, 因此在进行跟踪控制时, PID控制方法往往难以取得理想的效果, 而MPC等依赖模型的算法则能够根据模型预测补偿基因表达的时滞, 有效避免这一问题.
另一方面, 生物系统具有较强的随机性. 生物系统中, 参与反应的分子数量很少, 大约只有几十个, 根据薛定谔在《生命是什么》一书中提出的
$ \sqrt{n} $ 律: 一个具有$ n $ 个分子的反应系统的变异系数约为$ 1/\sqrt{n} $ [83], 基因表达反应过程中随机涨落引起的内蕴随机性是很明显的. 此外, 上游调控蛋白的随机性与环境因素的波动也会引入外部噪声[84], 使生物系统模型复杂化. 虽然微分方程与随机模型能够定量、随机地描述生物系统, 但随着网络规模的增大以及对含噪系统刻画的深入, 计算复杂性会大幅增加, 识别未知参数的难度也会大幅提高[82]. 另外, 基因网络中普遍存在着分子多靶点竞争现象, 调控模块之间高度耦合, 造成了网络内复杂的隐藏调控机制[85-86]. 这些因素使得建立精确的数学模型十分困难, 以致依赖于模型的MPC、ZAD等控制算法在模型精确度不高的情况下也难以发挥优势.总而言之, 在基因表达特性的限制下, PID控制不依赖于精确的数学模型, 相比依赖于模型的控制方法具有更好的可迁移性, 但无法处理基因表达过程中的时延和噪声; MPC、ZAD等控制方法虽然能够解决时延问题, 但数学模型的建立需要耗费大量的时间, 且数学模型不可通用, 在不同的控制问题下需要建立不同的模型. 在实际研究中, 研究者需要根据基因的表达特性选择合适的控制算法.
3. 总结与展望
生物控制与机器控制是控制领域的两个重要分支, 虽然在控制对象上, 生物与机器存在着很大差异, 但是在控制规律上, 两者构成了统一的整体. 近年来, 随着控制遗传学(Cybergenetics)概念的提出以及相关工具和平台的完善, 胞机交互引起了生物学家与控制学家们的广泛关注, 这种新兴的控制手段根据细胞状态实时调整控制信号, 在线优化细胞的动态特性, 相比利用合成基因线路的胞内控制更加便捷有效.
在细胞状态的监测与控制方面, 相关生物学工具与平台的发展为细胞控制提供了精准的控制手段. 图像处理算法与深度学习的发展使得计算机能够准确追踪每一个细胞, 从细胞影像中提取所需的细胞信号; 而光遗传技术的发展则使得研究者可以通过光照对细胞施加控制信号, 相较化学药物诱导等控制手段, 光照具有低伤害、高度可控、迅速可逆等优势. 高分辨率投影仪如DMD则可以通过控制每个像素点的光信号强度, 配合微流控系统, 将光控制信号精确到单个细胞, 从而在单细胞水平上研究细胞的基因表达特性以及细胞间的异质性[36, 81].
在控制算法方面, 尽管一些经典控制算法如PID控制、模型预测控制已经在细胞的基因表达控制上取得了一定成果, 但是目前的控制方法各自都有一定的局限性, 如何设计一套更适合生物系统的控制算法, 是胞机交互领域下一步应当考虑的问题. 一种想法是综合当前各种控制算法的优点, 例如采用PID控制作为整体框架, 同时利用MPC对系统状态进行预测, 解决PID控制不适用于长时延系统以及准确的数学模型难以建立的问题. 此外, 面对生物系统在各类干扰和参数下的不确定性, 以及模型的建立困难和不完整等特点, 模糊控制[87]、抗干扰控制[88]和深度强化学习[89]都是十分值得探索的方向. 同时, 应充分考虑分子调控的自身特性, 通过特定的网络结构和分子组成实现非常鲁棒的控制[9, 90-91].
另一方面, 当前受到广泛关注的人工智能技术也为细胞控制方法提供了新的思路. 最近, 美国麻省理工学院的Bashivan等[92]利用深度神经网络模型模拟目标视觉系统的行为, 并用该模型产生新的合成图像, 刺激猕猴的大脑, 发现猕猴视觉皮层的相应细胞产生了强烈反应, 证明了利用人工神经网络模拟神经细胞状态的可行性. 类似地, 哈佛大学的Ponce等[93]成功地利用生成对抗网络(Generative adversarial network, GAN) 和遗传算法生成了能够激活猴脑中识别面部的特定神经元的图像, 并根据神经元信号的实时反馈不断迭代优化合成图像, 反映出神经元兴奋程度在网络迭代优化中不断提高. 这些工作启发我们, 胞机交互不仅可以实现将基因线路替换成计算机程序的细胞反馈控制, 它还可以在细胞与计算机上建立起一套平行系统, 它们各自可以独立地运行, 但同时又相互对应: 计算机的模拟结果可以反映细胞的真实状态, 而细胞的状态响应又反过来进一步优化计算机模型, 实现并行优化的目的.
目前, 胞机交互的应用更多地局限于对特定荧光蛋白表达量的控制上, 真正能够对细胞的生命活动进行完全实时控制的工作仍然较少, 国内目前尚缺乏胞机交互相关工作发表. 虽然如此, 国内的科学家们在光遗传学与基因网络分析等方面已经有了一定的积累: 在光遗传学方面, 华东师范大学的Ye等[94]和Shao等[95]成功地利用光遗传学元件通过LED光照控制小鼠生成胰岛素, 同时将小鼠的血糖水平转化为电信号控制LED的亮度, 实现了小鼠血糖的反馈调节; 华东理工大学的Wang等[63]和Chen等[96]也分别构建了哺乳动物和细菌的光控基因表达系统, 能够在光照条件下快速启动或抑制下游基因的表达. 而在基因网络分析方面, 中山大学的Liang等[97]、Zhou等[98]、Zhang等[99]与中国科学院数学与系统科学研究院的Gu和Lv等[82, 100]都在基因调控网络的建模与控制、复杂网络系统的动力学分析等方面有出色的工作, 我们团队也在基因网络的竞争效应、噪声调控等研究方面有所积累[85-86]. 这表明, 胞机交互在国内有着深厚的基础和巨大的发展潜力, 只是还缺乏对不同领域研究成果的充分综合.
虽然基于胞机交互实现的细胞控制尚处于概念验证的尝试阶段, 但正是这些尝试性的细胞控制工作, 为我们解决系统生物学问题、治疗疑难疾病提供了全新的思路与手段, 具有广阔的发展前景. 首先, 通过胞机交互的方式, 研究者能得到关于被控基因网络的大量输入—输出数据, 有助于彻底揭示被控基因网络内部机制, 建立更加精确的动力学模型. 其次, 现阶段对相互独立的细胞状态的控制可以发展为对器官或组织中细胞状态的控制, 实现细胞的定向分化和器官的再生与修复等. 以及通过胞机交互与光遗传学的结合, 人们可以更加稳定高效地控制与疾病相关的离子通道[101], 治疗心脑血管疾病[102]、失明[103]、肿瘤[104]、神经疾病[105]等疑难杂症.
学科交叉是科学发展的必然趋势, 胞机交互作为计算机科学、控制科学、系统与合成生物学交叉的产物, 将会极大地改变人类对于生物系统的探索方式. 细胞与计算机的结合可以为人类打开细胞与基因网络的大门、深入理解细胞的内部机制、实现细胞的在线智能控制提供新途径, 为重大疾病防治、生物制造、新一代农业等做出贡献, 造福于人类的健康生活.
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图 1 利用人工合成基因线路控制细胞的基因表达
Fig. 1 Control gene expression using artificial synthetic gene circuits
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